DOI:
Authors:
Bilgin Vatansever
Abstract:
Aufgrund der immer noch hohen Zahl an offenen Fragenstellungen in den Biowissenschaften gilt die Proteomanalyse als eine der wichtigsten Forschungsgebiete in der Bioanalytik, welche sich intensiv mit der Aufklärung der Gesamtheit aller Proteine der Zelle beschäftigt. Auf dem Weg zum Lösen der Fragestellungen spielt die Schnelligkeit und die Zuverlässigkeit der ausgewählten Analysenmethode eine große Rolle. Aufgrund der geringen Menge an verfügbarem Probenmaterial werden häufig miniaturisierte chromatographische Trenntechniken wie Mikro-HPLC innerhalb der biowissenschaftlichen Forschung eingesetzt, welche mit verschiedenen massenspektrometrischen Detektionstechniken kombiniert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Elektrospay-Ionisation-(ESI)-Ionenfallen- Massenspektrometer sowohl für die qualitativen als auch für die quantitativen Analysen verwendet, welches sich auch als sehr empfindliche und schnelle Detektionsmethode herausstellte. Im ersten praktischen Teil der Arbeit wurden Gliadine identifiziert, die zu den Glutenproteinen gehören. Die erste Art der Identifizierung wurde mit Hilfe der intakten molekularen Massen der Gliadine durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde eine Tuningmethode durch Verwendung von Cytochrom-C optimiert. Mit dem optimierten System wurden unter 17 verschiedenen Peaks insgesamt 41 Proteinmassen ermittelt. Daraus wurden zwei a/ß-Gliadine, ein a-Gliadin und drei γ-Gliadine identifiziert. Da die zumal mit der Genauigkeit einer Ionenfalle – gemessene Proteinmasse keinesfalls ausreichende Informationen zur Proteinidentifizierung liefert, wurden als zweiter Weg die Proteine chymotryptisch und peptisch verdaut. Anschließend wurden die resultierenden Peptide mittels Tandem-MS durch Peptidfragmentfingerprinting (PFF)identifiziert. Mit Hilfe einer Kombination der Suchmaschinen Mascot, InsPect, OMSSA und deren Algorithmen wurden die Peptide identifiziert. Zur Identifizierung konnten diese sechs Gliadine eindeutig nach ihrer Gliadinfamilie zugeordnet werden. Eine eindeutige Identifizierung dieser sechs Gliadine war jedoch aufgrund der Homologie nicht möglich. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine Quantifizierungsmethode entwickelt, mit der ein toxisches 30-mer Peptid quantifiziert wurde. Das toxische 30-mer Peptid wurde durch peptischen Verdau in Gegenwart einer besonderen aktiven Denaturierungssubstanz (RapiGestTM) aus einem Weizenextrakt gewonnen. Dabei wurden die Verdaubedingungen hinsichtlich der Verdauzeit optimiert. Entsprechend dieser Optimierungsstudien wurden vier parallele peptische Verdaue zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit und zur Quantifizierung durchgeführt. Die Kalibrierung für die absolute Quantifizierung wurde mit einem isotopenmarkierten internen Standard vorgenommen. Als interner Standard wurde ein Peptid verwendet, welches dieselbe Sequenz des toxischen 30-mer Peptides hatte und am N-terminalen Valin durch sechs C-13-Atome isotopenmarkiert war. Der letzte Schritt dieser Quantifizierungsstudie bestand in der Auswertung der Rohdaten nach einem Feature-Finder-Algorithmus mit dem Ziel, dass durch die Automatisierung der Auswertungsprozesse eine schnelle Datenauswertung erreicht werden kann. Zur Kontrolle der automatischen Auswertung wurde eine manuelle Auswertung der Daten durchgeführt. Dabei wurde eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse beider Auswertungsprozesse festgestellt. Um diese Quantifizierungsmethode in der alltäglichen Praxis der Lebensmittelindustrie zu realisieren, wurde anschließend zu diesem Zweck das toxische 30-mer Peptid in einem kommerziell erhältlichen Weizenmehl von Typ 405 erfolgreich qualitativ und quantitativ untersucht.